内容


1 引言

1.1 Sanger测序和新一代测序

2 图书馆准备

3 扩增

3.1 乳液PCR

3.2 大桥PCR

4 测序

4.1 454焦磷酸测序

4.2 离子洪流半导体测序

4.3 测序结扎(固体)

4.4 可逆终止子测序(Illumina公司)

4.4.1 3'-O-阻断可逆终止

4.4.2 3'-畅通可逆终止

5 第三代测序

6 测序表观遗传修饰

6.5 亚硫酸氢盐测序

6.5.1 氧化亚硫酸盐测序

7 新一代测序中的应用

8 参考资料

介绍


人类基因组测序于2003年完成,经过13年的国际合作和三十亿美元的投资。人类基因组计划中使用桑格测序(尽管大量优化),自20世纪70年代发明的DNA测序的主要方法。


今天,用于测序的需求呈几何级数增长,与需要大量的基因组DNA进行快速分析,廉价地和准确。多亏统称为下一代测序新的测序技术,现在有可能在几个小时内测序整个人基因组。


Sanger测序和新一代测序


后面下一代测序(NGS)的原理是类似的的Sanger测序,这依赖于毛细管电泳。基因组链被分段,并且在每个片段的碱基被发射的信号来识别时的片段针对模板链连接。

需要用于测序单独的步骤,分离(通过电泳)和检测该Sanger法,这使得它难以自动化样品制备,它是在通过量,可扩展性和分辨率的限制。该NGS方法使用结合在Sanger测序开发来处理百万反应平行,导致非常高的速度,并可以通过在降低成本的技术的基于阵列的测序。那花了很多年,桑格方法的基因组测序项目,现在可以在NGS小时内完成,虽然较短读长(那在时间序列碱基数),少的准确性。


DNA测序的新一代方法有三个基本步骤:


文库制备:库使用DNA的随机片段创建,接着用自定义接头结扎

放大:该库是用克隆扩增的方法和扩增PCR

测序:DNA被使用几种不同方法之一进行测序

图书馆准备


首先,DNA被两种酶或通过超声处理(激励用超声波),以创建更小股线分段。然后适配器(合成DNA的短双链件)被连接到这些片段用DNA连接酶的帮助下,联接的DNA链的酶。适配器使序列成为结合到互补配对。


适配器被合成,使一端是“粘性”,而另一种是'钝'(非粘性),以期加入钝端的钝端DNA。这可能导致分子,因此形成二聚体之间的碱基配对的潜在的问题。为了防止这种情况,DNA的化学结构被利用,因为结扎开出的3'-OH和5'-P结束之间进行。通过从适配器的粘性末端除去磷酸盐和因此建立一个5'-OH端相反,DNA连接酶是无法形成两个末端之间的桥(图1)。


新一代测序文库制备

图1 | 新一代测序文库制备


为了测序是成功的,该文库片段需要在PCR菌落或'polonies“,因为它们是公知的,它包括一个特定的文库片段的许多拷贝的在空间上聚集。由于这些polonies附着在一个平面方式,所述阵列的特征可以酶促并行操纵。文库构建的这种方法比菌落采摘和大肠杆菌克隆的用于分离和扩增DNA为Sanger测序先前劳动密集型过程快得多,但是,这是在片段的读出长度为代价。


放大


文库扩增是必需的,以便从音序接收的信号是强到足以精确地检测。用酶扩增,可发生导致某些文库片段的优先扩增的现象,如“偏置”和“复制”。相反,有几种类型的扩增过程的其中使用的PCR来创建大量的DNA簇。


乳液PCR


乳液油,珠,PCR混合物和文库DNA混合以形成这导致微孔(形成的乳液图2)。


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