内容


1 引言

2 聚合酶链式反应(PCR)

2.1 底漆二聚体形成

3 DNA测序

3.1 桑格(双脱氧)DNA测序

3.2 基于荧光二脱氧DNA测序

3.3 新一代测序

3.4 测序修饰的DNA

3.4.1 亚硫酸氢盐测序

4 DNA指纹

4.5 短串联重复序列

4.6 STR分析

4.7 荧光STR分析

4.8 亲子鉴定

5 单核苷酸多态性(SNP)

6 DNA诊断和突变检测

7 实时PCR

7.1 基于探测的实时PCR

7.2 的TaqMan方法

7.3 荧光共振能量转移(FRET)

7.4 分子信标

7.5 蝎子引物

8 其他诊断方法

8.1 DNA微阵列

9 荧光原位杂交(FISH)

介绍


21世纪初在我们的各种生物,最显着的例子是人类基因组测序的DNA序列的认识经历了一场革命。基因组DNA的分析使我们了解进化了很多,而DNA序列中隐藏的语言不同生物之间的关系,由基因控制的机制,对疾病的易感性。整个基因组的测序是尚未然而,常规技术中,和遗传分析的其它方法用于快速和有效地分析DNA样本。这些方法和技术,如DNA指纹图谱,也改变法医学。


DNA测序,基因和取证分析所有的已建立的方法依赖于使用标记的寡核苷酸和/或脱氧或双脱氧三磷酸核苷,和需要的DNA聚合步骤。这可以是聚合酶链反应(在遗传分析STR分析),单核苷酸延伸(微型测序SNP分析),或聚合和DNA链终止(的组合Sanger测序)。


聚合酶链反应(PCR)


聚合酶链反应(PCR)是在分子生物学,诊断学,法医学和分子遗传学广泛使用,以扩增一个特定区域(一个技术扩增子的DNA样品的)。PCR可以放大珍贵的DNA样本(如在犯罪现场)的几个分子产生大量的DNA,从50到长度超过25 000个碱基对。


在PCR中,两个短寡核苷酸(PCR引物)的设计,使得每个互补于在该区域的两个靶链之一的3'-端待扩增:两个PCR引物限定的扩增子。由引物结合模板的区域中的一系列的循环(扩增图1)。PCR需要的DNA聚合酶。而所有生物体含有DNA聚合酶,即在PCR中使用的聚合酶来自嗜热菌栖热菌属aquaticus。这Taq聚合酶是耐热的,这意味着高达95℃的温度下可在PCR中使用,低的条件DNA双链体的稳定性。


聚合酶链反应(PCR)

图1 | 的聚合酶链反应(PCR)


在第一周期中,双链靶被分离成通过加热两个单模板链至95℃。然后将其冷却至55℃,以允许合成的寡核苷酸引物退火到模板链与它们的3'端彼此相对。然后将温度升高到72℃,对于热稳定的Taq DNA聚合酶的活性最适温度。聚合酶使用脱氧核糖核苷三磷酸(dNTPs浓度),以引物沿着生产的DNA两个新的双链(模板的长度延伸。图2)。


PCR循环

图2 | PCR循环的聚合酶链式反应的单个周期。


PCR的第二周期是第一周期的重复,并且每个新合成的单链也可以作为引物退火和延伸的模板。聚合酶只能尽可能延长DNA作为第一引物的位点,产生特定长度的DNA双链体。在所有的后续周期的扩增产生的PCR产物由两个引物的位点特定的长度,而这些PCR产物很快多于原本的目标分子。在理论上,?的PCR循环将产生2 ? PCR产物。


由凯利·穆利斯20世纪80年代发明的,聚合酶链反应已是穆利斯被授予了分子生物学,DNA诊断和法医学这样一个无处不在的影响诺贝尔奖。


引物二聚体的形成


不正确的扩增子在PCR中有时产生由于引物二聚体形成,其中,所述PCR引物杂交,和被放大的代替模板DNA(图3)。引物二聚体是最有可能以在PCR扩增开始时,当引物中存在的高浓度相对于模板。引物二聚体formatin可发生即使有几个错配的引物-二聚体双链体,其由结合于Taq聚合酶稳定。引物二聚体的形成是当几个PCR反应在同一个管(多重PCR)进行了一个特别的问题。


引物二聚体的形成

图3 | 引物二聚体形成的,而不是DNA模板扩增的形成与引物二聚体的扩增,可以对PCR产生不利影响。


在减少引物二聚体形成明显的步骤是,使它们具有低的自身互补来设计引物,但是这并不总是可能的,并且可能会导致引物二聚体的扩增甚至弱相互作用。“热启动”PCR技术已经发展到减轻引物二聚体的形成。在热启动PCR反应混合物最初缺少的重要组成部分,如Taq聚合酶,或Mg 2+(其中Taq聚合酶需要活性)。在第一周期开始长时间加热确保了所有的引物二聚体的变性,则该缺失的组件添加。PCR现在可以继续正常。该技术的主要缺点是污染的加入必须成分的,以打开反应管中的可能性。一个替代方法包括,关于加热解离的使用Taq聚合酶的非共价抑制剂(例如肽或抗体)。在另一方法中,PCR反应的一个重要组成部分是封闭在一个蜡丸,熔化在加热时,释放其内容。


DNA测序


所有这一切,因为在30年前由弗雷德·桑格在剑桥制定的方法是不可能的。桑格制定了关于他被授予他的第二个DNA测序(双脱氧法)的新方法诺贝尔文学奖,1980年。


桑格(双脱氧)DNA测序


桑格的DNA测序的双脱氧方法是常规地用于在实验室中的DNA测序的第一个方法。以下组件所需的Sanger测序:


DNA模板进行测序

在5'端标记的与寡核苷酸引物32 P

DNA测序聚合酶

四脱氧核苷三磷酸:的dATP,dGTP,的dCTP,dTTP的

四脱氧三磷酸核苷(缺少2'-和3'-羟基的三磷酸核苷):的ddATP,的ddGTP,ddCTP的,ddTTP(图4)

桑格测序是一个修改形式的DNA复制。引物杂交到模板的特定位点与聚合酶结合,并结合核苷酸组装模板的反向互补拷贝。这一过程将不提供在模板上的序列和用于此目的4测序反应在分开的试管中进行的任何信息。在每个管中的关键成分的少量,2',3'-二脱氧核苷三磷酸的溶液。双脱氧三磷酸核苷的ddATP加入到管1,的ddGTP至管2的ddCTP至管3和ddTTP到管4。


双脱氧核苷酸triphosphoates的结构(的ddNTPs)


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